Plasmide CRISPR d'Activation (h) COL4A3: sc-400903-ACT

COL4A3 code la chaîne α3 du collagène de type IV, un composant structural essentiel des membranes basales, qui contribue à l’assemblage du réseau et aux barrières de filtration spécifiques des tissus. Dans le glomérule rénal, les structures de collagène IV contenant COL4A3 soutiennent les interactions podocyte–endothélium, régulent l’organisation de la matrice extracellulaire et influencent l’adhésion cellulaire ainsi que la signalisation de mécanotransduction via des voies dépendantes des intégrines. Une expression ou une structure altérée de COL4A3 perturbe l’intégrité de la membrane basale et est fortement associée à des néphropathies héréditaires, notamment les maladies du spectre d’Alport et d’autres pathologies de la membrane basale glomérulaire. Comme le remodelage du collagène IV façonne les microenvironnements épithéliaux et endothéliaux, COL4A3 est également pertinent pour les études sur la fibrose, le renouvellement matriciel et la fonction barrière dans de multiples organes.

COL4A3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de COL4A3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

COL4A3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus COL4A3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription COL4A3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de COL4A3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus COL4A3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de COL4A3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie COL4A3 dans les cellules tumorales présentant une expression de COL4A3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.