Plasmide CRISPR d'Activation (h) CMPK: sc-405332-ACT

Le gène humain CMPK1 code la cytidine monophosphate kinase (CMPK), une kinase des nucléosides monophosphates qui catalyse la phosphorylation du CMP et de l’UMP en CDP et UDP, contribuant ainsi au maintien de pools équilibrés de nucléotides pyrimidiques nécessaires à la réplication de l’ADN, à la transcription de l’ARN et à la biosynthèse des phospholipides membranaires. En participant au recyclage des nucléotides et, plus largement, à l’homéostasie cellulaire des nucléotides, l’activité de CMPK1 s’inscrit à l’interface du contrôle métabolique de la progression du cycle cellulaire, de la fonction mitochondriale et des réponses au stress réplicatif. Des altérations du métabolisme des pyrimidines et des déséquilibres en nucléotides constituent des caractéristiques récurrentes d’états pathologiques prolifératifs et métaboliquement reprogrammés, faisant de CMPK1 un nœud d’intérêt pour étudier comment l’approvisionnement en nucléotides contraint la maintenance du génome et la fitness cellulaire.

CMPK Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CMPK1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CMPK Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CMPK1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CMPK1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CMPK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CMPK1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CMPK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CMPK dans les cellules tumorales présentant une expression de CMPK1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.