Clock Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401261-ACT

CLOCK umano codifica un fattore di trascrizione di base con dominio PAS di tipo elica–ansa–elica (bHLH) che forma un eterodimero con ARNTL/BMAL1 per guidare l’espressione genica circadiana attraverso elementi regolatori E-box. Questo oscillatore centrale regola la trascrizione ritmica di vie che governano il metabolismo, la progressione del ciclo cellulare, le risposte al danno al DNA e la segnalazione neuroendocrina, collegando i segnali legati all’ora del giorno all’omeostasi cellulare. I programmi dipendenti da CLOCK influenzano lo stato della cromatina e l’output trascrizionale nei diversi tessuti, plasmando ritmi fisiologici coordinati. Un’attività di CLOCK disregolata e il disallineamento circadiano sono stati associati a fenotipi del sonno e dell’umore, disfunzioni metaboliche e stati proliferativi alterati, rilevanti per la biologia delle malattie complesse.

Clock Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CLOCK senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Clock Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CLOCK nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CLOCK, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Clock. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CLOCK nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Clock nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Clock nelle cellule tumorali con espressione di CLOCK silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.