claudin-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400609-ACT

CLDN1 kodiert Claudin-1, ein tetraspanes Tight-Junction-Protein, das durch die Regulation der parazellulären Permeabilität und der Assemblierung von Tight-Junction-Strängen zur Integrität der epithelialen Barriere und zur apiko-basalen Polarität beiträgt. Claudin-1 ist an der Wechselwirkung („Cross-talk“) zwischen Tight Junctions und Adherens Junctions beteiligt und beeinflusst dadurch die Organisation des Zytoskeletts sowie Signalwege, die mit Differenzierung und Stressantworten verknüpft sind. Eine veränderte CLDN1-Expression oder -Lokalisation wird mit gestörter epithelialer Homöostase, Veränderungen von Zelladhäsion und -migration sowie Barrierefunktionsstörungen in entzündlichen und neoplastischen Kontexten in Verbindung gebracht. Als Bestandteil der Tight Junctions wird Claudin-1 zudem im Zusammenhang mit Wirt-Pathogen-Interaktionen und der gewebespezifischen Regulation der Permeabilität untersucht.

claudin-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CLDN1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

claudin-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CLDN1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CLDN1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen claudin-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CLDN1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von claudin-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des claudin-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CLDN1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.