Plasmide CRISPR d'Activation (h) Clathrin Light Chain B/CLTB: sc-404228-ACT

CLTB code la chaîne légère B de la clathrine, un composant essentiel des vésicules à manteau de clathrine qui régule l’endocytose médiée par les récepteurs et le trafic intracellulaire entre la membrane plasmique, les endosomes et le réseau trans-Golgi. En modulant la dynamique du treillis de clathrine avec la chaîne lourde de la clathrine et des complexes adaptateurs tels qu’AP2, CLTB contribue à la sélection des cargos, au bourgeonnement des vésicules et au recyclage des vésicules synaptiques dans des types cellulaires spécialisés. Cet axe de trafic influence la durée des signaux et le renouvellement des récepteurs, reliant les processus associés à CLTB à l’homéostasie cellulaire, à la prolifération et aux réponses au stress. Un trafic endocytaire dérégulé et le transport dépendant de la clathrine sont fréquemment étudiés dans le contexte de la neurobiologie, des voies d’entrée virale et des altérations de la signalisation des récepteurs liées au cancer.

Clathrin Light Chain B/CLTB Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CLTB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Clathrin Light Chain B/CLTB Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CLTB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CLTB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Clathrin Light Chain B/CLTB. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CLTB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Clathrin Light Chain B/CLTB au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Clathrin Light Chain B/CLTB dans les cellules tumorales présentant une expression de CLTB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.