CIS CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419665-ACT

Das murine Gen Cish kodiert das zytokininduzierbare SH2-haltige Protein (CIS), ein Mitglied der SOCS-Familie, das als Rückkopplungsinhibitor der Zytokinrezeptor-Signalübertragung fungiert. CIS bindet an phosphorylierte Rezeptorkomplexe und JAK-assoziierte Motive, um die nachgeschaltete Aktivität des JAK/STAT-Signalwegs abzuschwächen, und kann über SOCS-Box-abhängige Interaktionen den ubiquitinvermittelten Abbau von Signalkomponenten fördern. Über diese Mechanismen trägt CIS dazu bei, die Aktivierung von Immunzellen, die Hämatopoese und Entzündungsreaktionen fein abzustimmen, indem es Ausmaß und Dauer zytokingesteuerter Transkriptionsprogramme begrenzt. Eine dysregulierte Cish/CIS-Aktivität wurde mit veränderter Immunhomöostase und inflammatorischen Phänotypen in Verbindung gebracht, wodurch sich Cish/CIS als nützlicher Knotenpunkt für die Untersuchung von Signalabschwächung und Crosstalk zwischen Zytokinwegen eignet.

CIS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Cish-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CIS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Cish-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Cish-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CIS-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Cish-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CIS-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CIS-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Cish-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.