CIS CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402619-ACT

Das humane Gen **CISH** kodiert das cytokine-induzierbare SH2-haltige Protein (CIS), einen Adapter aus der SOCS-Familie, der die Signalübertragung von Cytokinrezeptoren abschwächt, indem er an phosphorylierte Zielproteine bindet und deren ubiquitinvermittelten Abbau fördert. CIS wirkt als negativer Feedback-Regulator der JAK/STAT-Signalwege nachgeschaltet von Rezeptoren für Zytokine der IL-2-Familie und verwandten immunmodulatorischen Signalen und beeinflusst damit Aktivierung, Proliferation und Differenzierung von Lymphozyten. Über seine SH2-Domäne und die SOCS-Box steuert CIS Signalstärke und -dauer und greift dabei in umfassendere Entzündungs- und wachstumsregulatorische Programme ein. Eine fehlregulierte CISH-Expression oder CIS-Aktivität wurde mit veränderter Immunreaktivität und der Biologie entzündlicher Erkrankungen in Verbindung gebracht, was CISH zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien von Cytokin-Signalnetzwerken macht.

CIS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CISH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CIS Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CISH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CISH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CIS-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CISH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CIS-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CIS-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CISH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.