Plasmide CRISPR d'Activation (h) Chr-A: sc-400405-ACT

CHGA code pour la chromogranine A (Chr-A), une protéine des granules de sécrétion enrichie dans les cellules neuroendocrines, qui contribue à la biogenèse des vésicules à cœur dense, au stockage des hormones peptidiques et à l’exocytose régulée. Le clivage protéolytique de la Chr-A génère des peptides bioactifs qui modulent la sécrétion neuroendocrine, la signalisation vasculaire et métabolique, ainsi que des voies répondant au stress. L’expression de CHGA suit la différenciation neuroendocrine et l’activité de la voie sécrétoire, ce qui en fait un marqueur utile et un nœud fonctionnel pour l’étude de la signalisation endocrine, du trafic vésiculaire et des réseaux de maturation des peptides. Des niveaux et des profils de clivage CHGA/Chr-A dérégulés sont associés à des phénotypes neuroendocrines et à la biologie des maladies liées à la sécrétion, ce qui soutient sa pertinence pour des recherches orientées biomarqueurs comme pour des approches mécanistiques.

Chr-A Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CHGA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Chr-A Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CHGA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CHGA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Chr-A. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CHGA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Chr-A au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Chr-A dans les cellules tumorales présentant une expression de CHGA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.