Chr-A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400405-ACT

CHGA kodiert Chromogranin A (Chr-A), ein Protein sekretorischer Granula, das in neuroendokrinen Zellen angereichert ist und die Biogenese dichtkerniger Vesikel (dense-core vesicles), die Speicherung von Peptidhormonen sowie die regulierte Exozytose unterstützt. Durch proteolytische Prozessierung von Chr-A entstehen bioaktive Peptide, die die neuroendokrine Sekretion sowie vaskuläre und metabolische Signalwege und stressresponsive Pfade modulieren. Die CHGA-Expression korreliert mit der neuroendokrinen Differenzierung und der Aktivität des sekretorischen Weges, was CHGA zu einem nützlichen Marker und funktionellen Knotenpunkt für Studien zur endokrinen Signalgebung, zum Vesikeltransport und zu Netzwerken der Peptidprozessierung macht. Fehlregulierte CHGA/Chr-A-Spiegel und veränderte Prozessierungsmuster sind mit neuroendokrinen Phänotypen und der Krankheitsbiologie sekretionsbezogener Erkrankungen assoziiert und unterstreichen seine Relevanz für biomarkerorientierte und mechanistisch ausgerichtete Forschung.

Chr-A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CHGA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Chr-A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CHGA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CHGA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Chr-A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CHGA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Chr-A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Chr-A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CHGA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.