CH25H CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402849-ACT

Humanes CH25H kodiert die Cholesterin-25-Hydroxylase, ein mit dem endoplasmatischen Retikulum assoziiertes Enzym, das Cholesterin in 25‑Hydroxycholesterin umwandelt – ein Oxysterol, das die Sterolhomöostase und die angeborene Immun-Signalübertragung moduliert. Die CH25H-Aktivität greift in Programme der Cholesterinbiosynthese und des -transports ein, einschließlich der SREBP-gesteuerten metabolischen Regulation, und beeinflusst nachgeschaltete, lipidvermittelte Kontrollmechanismen der Expression entzündungsrelevanter Gene. Als interferoninduzierbarer Faktor in myeloiden und epithelialen Kontexten wurde CH25H mit Wirt–Pathogen-Interaktionen sowie der Regulation von Zytokinantworten in Verbindung gebracht. Eine fehlregulierte CH25H/25‑Hydroxycholesterin-Signalgebung ist relevant für Untersuchungen zu metabolischer Entzündung, atheroskleroseassoziierten Signalwegen und Immunstörungen, wie sie bei Infektionen und autoimmunähnlichen Phänotypen beobachtet werden.

CH25H Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CH25H-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CH25H Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CH25H-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CH25H-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CH25H-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CH25H-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CH25H-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CH25H-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CH25H-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.