CDKN3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403243-ACT

CDKN3 (Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor 3) kodiert eine dualspezifische Phosphatase, die durch Dephosphorylierung cyclinabhängiger Kinasen den Zellzyklusverlauf moduliert, wobei sie insbesondere die CDK1/CDC2-Aktivität am G2/M-Übergang kontrolliert. Über die Regulation phosphorylierungsabhängiger Checkpoints beeinflusst CDKN3 den Eintritt in die Mitose, die Proliferationsrate sowie Programme der Genomstabilität, die mit DNA-Schadensantworten verknüpft sind. Eine dysregulierte CDKN3-Expression wurde in verschiedenen Krebskontexten mit einer veränderten Zellzykluskontrolle in Verbindung gebracht, was CDKN3 zu einem nützlichen molekularen Knotenpunkt für die Untersuchung proliferativer Signalwege und der Checkpoint-Anpassung macht. In humanen Zellen kann die gezielte Veränderung der CDKN3-Spiegel helfen zu klären, wie eine phosphatasevermittelte Feinabstimmung von CDKs die mitotische Genauigkeit und stressresponsive transkriptionelle Zustände prägt.

CDKN3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CDKN3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CDKN3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CDKN3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CDKN3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CDKN3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CDKN3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CDKN3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CDKN3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CDKN3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.