Plásmido CRISPR de Activación (h) CDKN3: sc-403243-ACT

CDKN3 (inhibidor 3 de quinasas dependientes de ciclina) codifica una fosfatasa de doble especificidad que modula la progresión del ciclo celular al desfosforilar quinasas dependientes de ciclina, con funciones destacadas en el control de la actividad de CDK1/CDC2 en la transición G2/M. Mediante la regulación de puntos de control dependientes de fosforilación, CDKN3 influye en la entrada en mitosis, la tasa de proliferación y programas de estabilidad genómica vinculados a las respuestas al daño del ADN. La expresión desregulada de CDKN3 se ha asociado con un control alterado del ciclo celular en múltiples contextos de cáncer, lo que lo convierte en un nodo molecular útil para estudiar la señalización proliferativa y la adaptación de los puntos de control. En células humanas, la perturbación de los niveles de CDKN3 puede ayudar a dilucidar cómo el ajuste de CDK mediado por fosfatasas da forma a la fidelidad mitótica y a estados transcripcionales sensibles al estrés.

CDKN3 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CDKN3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CDKN3 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CDKN3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CDKN3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CDKN3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CDKN3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CDKN3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CDKN3 en células tumorales con expresión de CDKN3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.