Plásmido CRISPR de Activación (h) CDKN1B/Kip1 p27: sc-400074-ACT

CDKN1B codifica p27^Kip1, un inhibidor de quinasas dependientes de ciclina que frena la progresión impulsada por CDK2 y CDK4/6 a través del punto de control G1/S al modular los complejos ciclina E/A–CDK2 y ciclina D–CDK4/6. p27 integra señales mitogénicas y antiproliferativas aguas abajo de vías como PI3K–AKT y TGF-β, y su abundancia está estrechamente controlada por ubiquitinación dependiente de fosforilación y degradación proteasomal. Mediante estos mecanismos, CDKN1B influye en programas de proliferación, quiescencia y diferenciación en diversos tipos celulares. La expresión alterada de CDKN1B o su localización incorrecta se asocia con frecuencia a un control desregulado del ciclo celular en la biología tumoral y a alteraciones en contextos endocrinos y del desarrollo.

CDKN1B/Kip1 p27 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CDKN1B sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CDKN1B/Kip1 p27 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CDKN1B en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CDKN1B, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CDKN1B/Kip1 p27. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CDKN1B y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CDKN1B/Kip1 p27 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CDKN1B/Kip1 p27 en células tumorales con expresión de CDKN1B silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.