Cdk5 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419602-ACT

Die Cyclin-abhängige Kinase 5 (Cdk5) ist eine prolin-gesteuerte Serin/Threonin-Kinase, die – anders als Zellzyklus-CDKs – vor allem in postmitotischen Zellen durch die Assoziation mit p35/p39 aktiviert wird und die neuronale Entwicklung und Funktion reguliert. In der Maus steuert Cdk5 die Dynamik des Zytoskeletts, die Axonführung, den Transport synaptischer Vesikel und aktivitätsabhängige Signalübertragung, indem es Substrate phosphoryliert, die die Mikrotubuli-Stabilität, die Endozytose und transkriptionelle Antworten modulieren. Es greift in Signalwege ein, die Calcium-Signalisierung, Kinasekaskaden und Proteostase kontrollieren, und integriert Signale, die die neuronale Morphologie und die Plastizität von Netzwerken prägen. Eine dysregulierte Cdk5-Aktivität wurde mit Mechanismen in Verbindung gebracht, die für Neurodegeneration, Neuroinflammation und neuropsychiatrische Phänotypen relevant sind, weshalb Cdk5 häufig Ziel von Studien zu neuronalen Stressantworten und Dysfunktionen auf Schaltkreisebene ist.

Cdk5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Cdk5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Cdk5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Cdk5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Cdk5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Cdk5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Cdk5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Cdk5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Cdk5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Cdk5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.