Cdk2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400111-ACT

CDK2 kodiert die Cyclin-abhängige Kinase 2 (Cdk2), eine Serin/Threonin-Kinase, die mitogene Signale mit der Zellzyklusprogression verknüpft. Im Komplex mit den Cyclinen E und A fördert Cdk2 den Übergang von G1 nach S sowie den Ablauf der S‑Phase, indem sie Substrate phosphoryliert, die an der Lizenzierung der DNA-Replikation, der Dynamik der Replikationsgabel und der Checkpoint-Kontrolle beteiligt sind. Die CDK2-Aktivität ist mit der Rb–E2F-Signalgebung, ATR/CHK1-vermittelten Replikationsstressantworten und CDK-Inhibitor-Netzwerken wie p21 und p27 koordiniert. Eine fehlregulierte CDK2-Expression oder -Aktivierung wird häufig im Zusammenhang mit proliferativen Pathologien und genomischer Instabilität untersucht, bei denen eine veränderte Zellzykluskontrolle onkogene Signalwege und die Toleranz gegenüber DNA-Schäden beeinflusst.

Cdk2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CDK2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Cdk2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CDK2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CDK2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Cdk2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CDK2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Cdk2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Cdk2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CDK2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.