CD92 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-408392-ACT

SLC44A1 kodiert CD92, ein membranständiges Protein der choline-transporter-ähnlichen Familie, das zur zellulären Cholinaufnahme und zum Phospholipidstoffwechsel beiträgt und so die Membranbiogenese sowie den Signalbedarf proliferierender Zellen unterstützt. Über die Beeinflussung der Cholinverfügbarkeit ist CD92 mit Signalwegen verknüpft, die die Phosphatidylcholin-Synthese, die Homöostase von Organellenmembranen und allgemeinere lipidassoziierte Stressantworten steuern. Eine veränderte Expression oder Regulation von Komponenten des Cholinstoffwechsels bzw. -transports wurde mit dem in der Krebsbiologie beobachteten metabolischen Remodeling sowie mit Störungen in neuroimmunologischen und entzündlichen Kontexten in Verbindung gebracht, wodurch SLC44A1 einen hilfreichen Knotenpunkt für mechanistische Studien des Membranlipidstoffwechsels darstellt. Die Lokalisation und Transportaktivität von CD92 liefern zudem einen gut nutzbaren Readout, um zu untersuchen, wie Nährstofftransport mit Programmen für Zellwachstum und Differenzierung zusammenspielt.

CD92 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC44A1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CD92 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC44A1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC44A1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CD92-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC44A1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CD92-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CD92-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC44A1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.