CD28 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401525-ACT

Humanes CD28 kodiert einen kostimulatorischen Rezeptor, der auf T-Zellen exprimiert wird und an Liganden der B7-Familie (CD80/CD86) bindet, um die Signalübertragung des T‑Zell‑Rezeptors zu verstärken und die vollständige Aktivierung zu unterstützen. Die Bindung von CD28 fördert die IL‑2‑Produktion, das Überleben und die metabolische Reprogrammierung über die PI3K–AKT–mTOR-, NF‑κB- und MAPK-Signalwege und beeinflusst damit Proliferation, Differenzierung und das Zytokinprofil. Eine fehlregulierte CD28-Signalisierung wird mit immunvermittelter Pathologie und tumorbedingter Immunflucht in Verbindung gebracht, und eine veränderte Expression oder Signalübertragung kann die Reaktionen in Modellen der Autoimmunität, chronischer Infektion und Tumorimmunologie beeinflussen. CD28 ist daher ein zentraler Knotenpunkt für die Untersuchung von Aktivierungsschwellen der T‑Zellen, Checkpoint-Interaktionen und der Dynamik des Immunmikromilieus.

CD28 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CD28-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CD28 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CD28-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CD28-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CD28-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CD28-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CD28-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CD28-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CD28-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.