CatSper CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403796-ACT

CATSPER1 kodiert CatSper, eine spermiumspezifische, pH- und spannungsaktivierte Untereinheit eines Calciumkanals, die zum CatSper-Komplex in der Flagellenmembran beiträgt. Der durch CatSper vermittelte Ca2+-Einstrom ist ein zentraler Regulator der hyperaktivierten Spermienmotilität sowie der kapazitationsassoziierten Signalübertragung und verknüpft die Ionhomöostase mit nachgeschalteten Veränderungen der Flagellenschlagmuster und der Energienutzung. Eine Störung der CATSPER1-Funktion beeinträchtigt calciumabhängige Motilitätsprogramme und wird mit Phänotypen eingeschränkter männlicher Fertilität in Verbindung gebracht, was CATSPER1 zu einem wichtigen Ziel für mechanistische Studien der Spermienphysiologie macht. In der humanen reproduktionsbiologischen Forschung wird CATSPER1 zudem genutzt, um zu untersuchen, wie die Regulation von Ionenkanälen mit Second-Messenger-Signalwegen und der Spermienfunktion unter physiologischen und Stressbedingungen zusammenwirkt.

CatSper Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CATSPER1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CatSper Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CATSPER1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CATSPER1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CatSper-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CATSPER1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CatSper-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CatSper-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CATSPER1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.