Plásmido CRISPR de Activación (m) CAPS-1: sc-424190-ACT

Cadps codifica CAPS-1, una proteína activadora dependiente de Ca2+ que promueve el cebado (priming) de vesículas de núcleo denso y regula la exocitosis regulada en células neuroendocrinas y neuronales. Al coordinar la preparación de las vesículas y acoplar la señalización de Ca2+ con la secreción, CAPS-1 favorece la liberación de neurotransmisores y neuropéptidos, la secreción hormonal y la función sináptica. La actividad de CAPS-1 se interrelaciona con la fusión de membranas mediada por SNARE y con procesos del ciclo presináptico de vesículas que modulan la excitabilidad y la comunicación en red. La desregulación del control de la vía secretora es relevante para mecanismos estudiados en fenotipos del neurodesarrollo y neuropsiquiátricos, así como en defectos de secreción endocrina, lo que convierte a Cadps en ratón en un modelo útil para la disfunción celular ligada a la secreción.

CAPS-1 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Cadps sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CAPS-1 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Cadps en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Cadps, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CAPS-1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Cadps y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CAPS-1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CAPS-1 en células tumorales con expresión de Cadps silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.