Plasmide CRISPR d'Activation (h) CaMKV: sc-404961-ACT

CAMKV code pour CaMKV (protéine apparentée aux kinases dépendantes de Ca2+/calmoduline), un membre atypique de la famille CaMK impliqué dans la signalisation neuronale et la régulation, dépendante de l’activité, de l’expression génique. CaMKV a été associée à des processus sensibles au calcium/à la calmoduline qui influencent la plasticité synaptique, le développement des neurites et la dynamique du cytosquelette, en intégrant les flux calciques en amont à des programmes transcriptionnels en aval. Une dérégulation de l’expression ou de la signalisation de CAMKV a été associée à des phénotypes neurodéveloppementaux et neuropsychiatriques, ce qui en fait une cible pertinente pour étudier les mécanismes moléculaires qui façonnent la connectivité et l’excitabilité neuronales. CAMKV humain constitue donc une cible utile pour disséquer les voies dépendantes du calcium dans des modèles neuronaux et des systèmes cellulaires apparentés.

CaMKV Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CAMKV sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CaMKV Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CAMKV dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CAMKV, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CaMKV. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CAMKV natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CaMKV au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CaMKV dans les cellules tumorales présentant une expression de CAMKV silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.