Brn-2/BRN2/POU3F2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-422351-ACT

Pou3f2 kodiert den POU-Domänen-Transkriptionsfaktor Brn-2/BRN2/POU3F2, einen zentralen Regulator der neuralen Linienfestlegung und -reifung in der Maus. BRN2 bindet an oktamerähnliche DNA-Motive, um Genprogramme zu koordinieren, die Neurogenese, neuronale Differenzierung und die Aufrechterhaltung der neuralen Identität steuern, und ist dabei in übergeordnete transkriptionelle Netzwerke eingebunden, die die Chromatinzugänglichkeit und Zellzustandsübergänge mitprägen. Während der Entwicklung und in adulten Geweben beeinflusst die Pou3f2-Aktivität sowohl Neuralleisten-abgeleitete als auch Linien des zentralen Nervensystems und ist damit mit Prozessen wie Progenitor-Proliferation, Migration und synaptischer Genexpression verknüpft. Fehlregulierte, BRN2-assoziierte transkriptionelle Schaltkreise wurden u. a. im Zusammenhang mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen und Linienplastizität in Krebsmodellen untersucht, was seine Nutzung als Knotenpunkt zur Analyse von Signalwegen und Gen-Netzwerken unterstützt.

Brn-2/BRN2/POU3F2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Pou3f2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Brn-2/BRN2/POU3F2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Pou3f2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Pou3f2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Brn-2/BRN2/POU3F2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Pou3f2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Brn-2/BRN2/POU3F2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Brn-2/BRN2/POU3F2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Pou3f2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.