Plásmido CRISPR de Activación (h) BRAP: sc-403847-ACT

BRAP (proteína asociada a BRCA1) es una ligasa E3 de ubiquitina de tipo RING citoplasmática que modula la estabilidad de las proteínas y la salida de señalización al coordinar el control, dependiente de la ubiquitinación, de los componentes de las vías. Se ha implicado en la regulación de la dinámica de señalización MAPK/ERK, influyendo en la progresión del ciclo celular, las respuestas al estrés y la proteostasis mediante efectos sobre el recambio mediado por ubiquitina y la atenuación de señales. Al moldear la transducción de señales y las vías inflamatorias/de estrés, la expresión de BRAP y su variación funcional se han asociado con alteraciones de la homeostasis celular y con la susceptibilidad a fenotipos relevantes para enfermedad, incluidos procesos cardiometabólicos y vinculados a la neurodegeneración. Estas propiedades hacen de BRAP un objetivo útil para desentrañar cómo las redes de ligasas de ubiquitina ajustan la señalización impulsada por fosforilación y los programas transcripcionales posteriores en células humanas.

BRAP El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de BRAP sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

BRAP El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus BRAP en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional BRAP, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de BRAP. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo BRAP y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de BRAP en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía BRAP en células tumorales con expresión de BRAP silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.