BPAG1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403388-ACT

DST kodiert das bullöse-Pemphigoid-Antigen 1 (BPAG1), ein großes Zytolinker-Protein, das Intermediärfilamente mit membranassoziierten Komplexen verbindet und so die Organisation des Zytoskeletts, den Vesikeltransport und die mechanische Widerstandsfähigkeit von Zellen unterstützt. Humane BPAG1-Isoformen sind vor allem in mehrschichtigen Epithelien und Neuronen ausgeprägt, wo sie zur Integrität der Hemidesmosomen beitragen und die Zell‑Matrix‑Adhäsion stabilisieren. Über diese strukturellen Funktionen beeinflusst BPAG1 Prozesse wie Migration, Polarität und stressabhängige Signalwege, die von einem koordinierten Crosstalk zwischen Aktin, Mikrotubuli und Intermediärfilamenten abhängen. Eine Fehlregulation oder veränderte Antigenität von BPAG1 ist mit blasenbildenden Hauterkrankungen und neurodegenerativen Phänotypen assoziiert, wodurch DST ein nützliches Ziel zur Untersuchung von Zytoskelett-Dysfunktionen und Mechanismen der Gewebefragilität darstellt.

BPAG1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DST-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BPAG1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DST-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DST-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BPAG1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DST-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BPAG1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BPAG1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DST-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.