Plásmido CRISPR de Activación (h) betaKlotho: sc-401614-ACT

El KLB humano codifica betaKlotho, un correceptor transmembrana de paso único que confiere especificidad de ligando a la señalización endocrina mediada por FGF, destacando especialmente al facilitar la señalización FGF19/FGFR4 en hepatocitos y la señalización FGF21/FGFR1c en tejidos metabólicos. A través de estas vías, betaKlotho regula la homeostasis de los ácidos biliares, el metabolismo de la glucosa y los lípidos, y el balance energético, modulando MAPK/ERK aguas abajo y programas transcripcionales relacionados. La alteración de la expresión o función de KLB se ha vinculado con desregulación metabólica, incluida la obesidad, la resistencia a la insulina y procesos asociados a la enfermedad de hígado graso no alcohólico, y puede influir en el crecimiento hepático y las respuestas al estrés. Dado que KLB es un determinante clave de la respuesta a FGF endocrinos, se estudia con frecuencia en modelos de detección de nutrientes, señalización en hepatocitos y comunicación entre tejido adiposo e hígado.

betaKlotho El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de KLB sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

betaKlotho El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus KLB en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional KLB, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de betaKlotho. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo KLB y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de betaKlotho en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía betaKlotho en células tumorales con expresión de KLB silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.