betaKlotho CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401614-ACT

Das humane KLB-Gen codiert für betaKlotho, einen Single-Pass-Transmembran-Korezeptor, der der endokrinen FGF-Signalgebung Ligandenspezifität verleiht, insbesondere durch die Ermöglichung der FGF19/FGFR4-Signalgebung in Hepatozyten und der FGF21/FGFR1c-Signalgebung in Stoffwechselgeweben. Über diese Signalwege reguliert betaKlotho die Gallensäurehomöostase, den Glukose- und Lipidstoffwechsel sowie die Energiebilanz, indem es nachgeschaltete MAPK/ERK- und verwandte transkriptionelle Programme moduliert. Eine veränderte KLB-Expression oder -Funktion wurde mit einer metabolischen Dysregulation in Verbindung gebracht, darunter Adipositas, Insulinresistenz und Prozesse im Zusammenhang mit der nichtalkoholischen Fettlebererkrankung, und kann das hepatische Wachstum sowie Stressantworten beeinflussen. Da KLB ein zentraler Determinant der Responsivität auf endokrine FGFs ist, wird es häufig in Modellen der Nährstoffwahrnehmung, der Hepatozyten-Signalübertragung und des Crosstalks zwischen Fettgewebe und Leber untersucht.

betaKlotho Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen KLB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

betaKlotho Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des KLB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der KLB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen betaKlotho-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native KLB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von betaKlotho-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des betaKlotho-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem KLB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.