BCMO1 CRISPR Activation Plasmid (h2): sc-405374-ACT-2

Das humane BCO1-Gen kodiert die β-Carotin-15,15′-Monooxygenase 1 (BCMO1), eine zytosolische, nicht-hämhaltige, eisenabhängige Dioxygenase, die die zentrale Spaltung von mit der Nahrung aufgenommenem β-Carotin katalysiert und dabei all-trans-Retinal erzeugt, einen wichtigen Vorläufer der Retinsäure und der visuellen Chromophore. Durch die Kontrolle der Retinoidverfügbarkeit beeinflusst BCMO1 die Retinoid-Signalübertragung über RAR/RXR-abhängige Transkriptionsprogramme, die die epitheliale Differenzierung, den Lipidstoffwechsel und Antworten auf oxidativen Stress regulieren. Genetische Variation oder eine veränderte Expression von BCO1 wurde mit interindividuellen Unterschieden in der Effizienz der Provitamin-A-Umwandlung in Verbindung gebracht und mit Merkmalen assoziiert, die von der Vitamin-A-Versorgung über metabolische Phänotypen bis hin zur retinalen/okulären Biologie reichen. Geneditierungswerkzeuge für BCO1/BCMO1 ermöglichen mechanistische Untersuchungen des Carotinoidstoffwechsels, der Retinoid-Homöostase und nachgeschalteter Transkriptionsnetzwerke in relevanten humanen Zellmodellen, einschließlich Studien zu Ernährungs–Gen-Interaktionen und zur Signalwegvernetzung mit dem Lipidhandling und antioxidativen Abwehrmechanismen.

BCMO1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen BCO1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BCMO1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h2) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des BCO1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der BCO1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BCMO1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native BCO1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BCMO1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BCMO1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem BCO1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.