Plasmide CRISPR d'Activation (h) Bad: sc-400419-ACT

Le gène humain BAD (BCL2 associated agonist of cell death) code Bad, une protéine pro-apoptotique de la famille BCL‑2 appartenant au sous-groupe « BH3-only », qui intègre au niveau des mitochondries les signaux de survie et de mort cellulaire. Bad favorise la perméabilisation de la membrane externe mitochondriale en se liant à des protéines anti-apoptotiques telles que BCL‑2 et BCL‑XL et en les neutralisant, facilitant ainsi l’activation de BAX/BAK et l’apoptose dépendante des caspases. Son activité est étroitement régulée par phosphorylation et séquestration en aval des voies de signalisation PI3K/AKT et MAPK, reliant la signalisation des facteurs de croissance à l’apoptose intrinsèque et au contrôle métabolique. Une dérégulation de la signalisation de BAD a été impliquée dans des modifications du seuil d’apoptose, pertinentes pour la biologie du cancer, les maladies neurodégénératives et les réponses au stress.

Bad Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BAD sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Bad Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BAD dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BAD, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Bad. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BAD natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Bad au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Bad dans les cellules tumorales présentant une expression de BAD silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.