B7-H4 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-433877-ACT

Vtcn1 kodiert das immunregulatorische Protein B7-H4, einen Liganden der B7-Familie, der überwiegend mit inhibitorischer Signalübertragung in T‑Zell-Antworten sowie mit einer umfassenderen Kontrolle der Immunaktivierung in peripheren Geweben in Verbindung gebracht wird. Die Expression von B7-H4 auf antigenpräsentierenden Zellen und in verschiedenen stromalen oder epithelialen Kompartimenten kann die Zytokinproduktion, die T‑Zell-Proliferation und die Immuntoleranz beeinflussen und verknüpft diese Achse damit mit Signalwegen, die die adaptive Immunität und die inflammatorische Homöostase steuern. Eine dysregulierte B7-H4-Expression wurde im Kontext von Tumor-Immunevasion, chronischer Entzündung und autoimmunitätsassoziierter Immunsuppression untersucht, was sie zu einem nützlichen Knotenpunkt macht, um checkpoint-ähnliche Regulation in Mausmodellen zu analysieren. Darüber hinaus ist die Biologie von Vtcn1 relevant für Untersuchungen zur myeloid‑lymphoiden Wechselwirkung und zur durch das Gewebemikromilieu getriebenen Immunmodulation.

B7-H4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Vtcn1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

B7-H4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Vtcn1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Vtcn1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen B7-H4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Vtcn1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von B7-H4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des B7-H4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Vtcn1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.