ATGL Plásmido CRISPR/Cas9 KO (h2): sc-401711-KO-2

Descripción general

PNPLA2 codifica la lipasa de triglicéridos del tejido adiposo (ATGL), una enzima limitante de la velocidad que inicia la hidrólisis de triglicéridos para generar diacilglicerol y ácidos grasos libres destinados a la β‑oxidación mitocondrial y a la señalización lipídica. La actividad de ATGL favorece el recambio de las gotas lipídicas y la homeostasis energética celular, actuando dentro de un control coordinado de la lipólisis junto con cofactores como ABHD5/CGI‑58 y vías posteriores que incluyen programas metabólicos regulados por PPAR. La desregulación de la lipólisis mediada por PNPLA2 se ha relacionado con una acumulación lipídica anómala y con alteraciones en el flujo de ácidos grasos, procesos que se entrecruzan con la sensibilidad a la insulina, la inflamación y la señalización de estrés celular. En consecuencia, PNPLA2/ATGL se estudia ampliamente en adipocitos, hepatocitos, miocitos y macrófagos para desentrañar los mecanismos de almacenamiento frente a movilización de lípidos en contextos relevantes para enfermedades metabólicas.

El plásmido CRISPR/Cas9 KO ATGL (h2) es un conjunto de plásmidos diseñado para la interrupción selectiva del gen PNPLA2 en líneas celulares human. Cada plásmido del conjunto coexpresa un ARN guía específico (sgRNA) único, dirigido a un sitio distinto dentro del locus PNPLA2, junto con la nucleasa Cas9 de Streptococcus pyogenes, y codifica GFP para permitir la identificación fluorescente y el enriquecimiento de las células transfectadas con éxito. Esta estrategia multiguía aumenta la probabilidad de inducir desplazamientos de marco de lectura o deleciones que produzcan una inactivación funcional, ofreciendo una alternativa más robusta a los enfoques de guía única. Las DSB inducidas en múltiples sitios se resuelven mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ) o, cuando se utiliza con la plantilla donante HDR incluida, mediante reparación dirigida por homología (HDR) en un sitio diana definido dentro del locus.

Cuando se utiliza junto con el donante HDR que expresa RFP, la fluorescencia de GFP y RFP puede utilizarse conjuntamente para distinguir las poblaciones de células transfectadas de las editadas, lo que agiliza los flujos de trabajo de clasificación y selección de clones basados en citometría de flujo.

Donante de reparación dirigida por homología (HDR) — Casete de puromicina con reportero RFP

Para aplicaciones que requieren clones knockout confirmados y seleccionables, el plásmido HDR ATGL (h2) incluye un constructo donante HDR que contiene un casete de resistencia a la puromicina (PuroR) y un reportero de proteína fluorescente roja (RFP), flanqueado por brazos de homología específicos de un sitio diana definido PNPLA2.
Cuando se cotransfecciona con el plásmido ATGL CRISPR/Cas9 KO (h2):

• El casete PuroR-RFP se integra en el sitio de corte de Cas9 mediante HDR, interrumpiendo el marco de lectura abierto PNPLA2.
  La fluorescencia de la RFP proporciona un indicador visual inmediato del éxito de la integración, lo que permite la identificación o clasificación basada en la fluorescencia de las células editadas antes o junto con la selección con puromicina.
  Las células editadas con éxito se confirman mediante la resistencia a la puromicina, lo que reduce sustancialmente la carga de cribado de clones.
  Esta estrategia de selección es ideal para generar líneas celulares KO clonales estables para estudios funcionales posteriores, cribado de fármacos o desarrollo de modelos.

Sistema de eliminación del casete Cre-lox

La construcción donante HDR cuenta con sitios loxP que flanquean el casete de selección PuroR-RFP para permitir la eliminación limpia del marcador tras la confirmación del clon. La expresión transitoria de la recombinasa Cre a través del vector Cre: sc-418923 incluido extirpa el casete, dejando un sitio loxP residual mínimo dentro del locus PNPLA2 y eliminando posibles efectos de confusión en los ensayos posteriores.
Este enfoque en dos pasos:

• Minimiza la alteración de la arquitectura local de la cromatina y de los elementos reguladores vecinos
  Restaura un contexto genómico casi nativo en el locus editado
  Permite reutilizar la estrategia de selección con puromicina en la misma línea celular para ediciones adicionales

Características principales

• gRNA dirigido a los exones PNPLA2 críticos para la función ATGL
  Coexpresión de SpCas9 y sgRNA a partir de un único plásmido para una administración simplificada
  Donante HDR con resistencia a la puromicina para la selección positiva de clones
  Casete PuroR flanqueado por loxP con vector de recombinasa Cre para la eliminación sin fisuras del marcador
  Se suministra listo para su uso mediante transfección

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.