Ataxin-3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-417498-ACT

ATXN3 kodiert Ataxin-3, ein deubiquitinierendes Enzym, das Ubiquitinketten editiert und zur Regulation der Proteinkontrolle über das Ubiquitin-Proteasom-System sowie autophagie-assoziierte Signalwege beiträgt. Ataxin-3 ist an Proteostase und zellulären Stressantworten beteiligt, indem es die Stabilität und den Abbau fehlgefalteter oder aggregationsanfälliger Substrate moduliert; zudem bestehen funktionelle Verbindungen zur transkriptionellen Regulation und zu DNA-schadensassoziierten Signalprozessen. Erweiterte Polyglutamin-Trakte in ATXN3 sind mit der spinozerebellären Ataxie Typ 3 (Machado–Joseph-Krankheit) assoziiert, einer neurodegenerativen Erkrankung, die durch Proteinaggregation und eine erhöhte Vulnerabilität von Neuronen gekennzeichnet ist. Diese Eigenschaften machen ATXN3 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung von Ubiquitin-Signalgebung, Aggregatbiologie und Signalwegen, die die neuronale Homöostase steuern.

Ataxin-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ATXN3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Ataxin-3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ATXN3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ATXN3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Ataxin-3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ATXN3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Ataxin-3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Ataxin-3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ATXN3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.