ASM CRISPR Activation Plasmid (m): sc-423033-ACT

Das Mausgen *Smpd1* kodiert die saure Sphingomyelinase (ASM), eine lysosomale Hydrolase, die Sphingomyelin zu Ceramid und Phosphorylcholin umsetzt und damit den Sphingolipidumsatz sowie den Membranumbau reguliert. Die ASM-abhängige Ceramidbildung beeinflusst endolysosomale Funktionen, das Crosstalk zwischen Autophagie und Lysosom sowie stressresponsive Signalwege, die mit Entzündung und Zelltod verknüpft sind. Eine Störung der ASM-Aktivität beeinträchtigt die Lipidhomöostase und fördert die Anreicherung von Sphingomyelin – ein Kennzeichen lysosomaler Speicherpathologien sowie einer veränderten Myelin- und Immunzellfunktion. In der biomedizinischen Forschung wird *Smpd1*/ASM genutzt, um die Lysosomenbiologie, ceramidvermittelte Signalgebung und Mechanismen zu untersuchen, die den Lipidstoffwechsel mit Neurodegeneration und metabolischem Stress verbinden.

ASM Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Smpd1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ASM Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Smpd1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Smpd1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ASM-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Smpd1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ASM-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ASM-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Smpd1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.