ASIC1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401452-ACT

Humanes ASIC1 (acid-sensing ion channel subunit 1) kodiert einen protonengesteuerten, natriumpermeablen Ionenkanal der ENaC/DEG-Familie, der auf eine extrazelluläre Ansäuerung reagiert. ASIC1 trägt über Membrandepolarisation zur neuronalen Erregbarkeit und zur Kalziumsignalgebung bei und prägt dadurch synaptische Transmission, sensorische Transduktion und aktivitätsabhängige Plastizität. Durch die Kopplung von pH-Schwankungen an Ionenflüsse greift ASIC1 in Signalwege ein, die mit ischämischen und entzündlichen Mikromilieus verknüpft sind, einschließlich exzitotoxischer Stressantworten und neuroimmuner Signalübertragung. Eine fehlregulierte ASIC1-Aktivität und -Expression wurde in Modellen für Neurodegeneration, Schmerz, angstbezogene Verhaltensweisen und tumorassoziierte Azidose untersucht, was seine Relevanz für mechanistische Studien pH-abhängiger Signalgebung unterstreicht.

ASIC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ASIC1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ASIC1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ASIC1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ASIC1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ASIC1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ASIC1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ASIC1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ASIC1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ASIC1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.