Arginase 2/ARG2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400639-ACT

Das humane ARG2-Gen kodiert Arginase 2, ein mitochondriales Metalloenzym, das L-Arginin zu L-Ornithin und Harnstoff hydrolysiert und dadurch die zelluläre Verfügbarkeit von Arginin sowie die nachgelagerte Polyamin- und Prolinbiosynthese beeinflusst. Durch die Konkurrenz mit Stickstoffmonoxid-Synthasen um L-Arginin wirkt ARG2 auf die NO-Signalübertragung, das Redoxgleichgewicht und die Entzündungspolarisierung in Immun- und Stromakompartimenten ein. Die ARG2-Aktivität steht zudem in Zusammenhang mit der stickstoffbezogenen Verarbeitung urea-zyklusnaher Stoffwechselwege, dem mitochondrialen Metabolismus und Netzwerken des Aminosäuretransports, die Proliferation und Stressantworten regulieren. Eine dysregulierte ARG2-Expression wurde mit veränderter Immunmetabolik, vaskulärer Dysfunktion und einem Umbau des Tumormikromilieus in Verbindung gebracht, wodurch ARG2 einen nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien argininabhängiger Signalwege darstellt.

Arginase 2/ARG2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ARG2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Arginase 2/ARG2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ARG2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ARG2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Arginase 2/ARG2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ARG2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Arginase 2/ARG2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Arginase 2/ARG2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ARG2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.