ANO2 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-433990-ACT

Ano2 kodiert ANO2 (TMEM16B), einen calciumaktivierten Chloridkanal, der die Membranerregbarkeit formt, indem er intrazelluläre Ca2+-Signale mit Cl−-Fluss koppelt. In Neuronen und sensorischen Epithelien trägt ANO2 zur aktivitätsabhängigen Repolarisation, Signalverstärkung und Anpassung der Aktionspotenzialfrequenz bei und verbindet damit die Ca2+-Dynamik mit der Ionenhomöostase und der synaptischen Verarbeitung. Dieser Kanal ist an Stimulus-Transduktionsprogrammen beteiligt, die für den Geruchssinn und andere sensorische Signalwege relevant sind, und eine veränderte ANO2-Funktion wird im Zusammenhang mit neuronaler Hyperexzitabilität und sensorischen Störungen untersucht. Mausmodelle für Ano2 unterstützen mechanistische Studien dazu, wie eine Ca2+-aktivierte Anionenleitfähigkeit die Physiologie neuronaler Schaltkreise und die zelluläre Signalübertragung beeinflusst.

ANO2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Ano2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ANO2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Ano2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Ano2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ANO2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Ano2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ANO2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ANO2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Ano2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.