Plasmide CRISPR d'Activation (h) Amphiphysin I: sc-403904-ACT

AMPH code l’amphiphysine I, un adaptateur endocytaire contenant un domaine BAR, capable de détecter et d’induire la courbure membranaire et de coordonner l’endocytose médiée par la clathrine. Elle interagit avec la dynamine et d’autres partenaires possédant un domaine SH3 afin de réguler le recyclage des vésicules synaptiques, le trafic membranaire et le remodelage lié à l’actine au niveau des terminaisons présynaptiques. Par son rôle dans le bourgeonnement et le recyclage vésiculaires, l’amphiphysine I contribue à l’homéostasie de la signalisation neuronale et est couramment étudiée dans les voies qui gouvernent la transmission synaptique et la dynamique des endosomes. Des altérations de l’expression ou de la fonction d’AMPH ont été examinées dans le contexte de la neurobiologie et des mécanismes des maladies neurodégénératives, où des défauts de trafic et de maintien synaptique sont fréquents.

Amphiphysin I Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AMPH sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Amphiphysin I Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AMPH dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AMPH, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Amphiphysin I. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AMPH natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Amphiphysin I au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Amphiphysin I dans les cellules tumorales présentant une expression de AMPH silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.