Amelogenin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403337-ACT

AMELY codifica l’amelogenina, una proteina secreta della matrice extracellulare che contribuisce all’organizzazione della matrice dello smalto durante l’odontogenesi e sostiene la mineralizzazione dello smalto regolando la crescita dei cristalli di idrossiapatite e il rimodellamento della matrice. L’amelogenina partecipa a interazioni epitelio–mesenchimali strettamente coordinate e a processi di maturazione guidati da proteasi che modellano la formazione dello smalto, collegando l’espressione di AMELY ai programmi di sviluppo dei tessuti mineralizzati. La variazione dei percorsi associati all’amelogenina è rilevante per l’integrità strutturale dello smalto ed è spesso sfruttata nella genetica umana perché le differenze di sequenza tra AMELX e AMELY forniscono marcatori informativi per il sesso in ambito forense e antropologico. Nella ricerca biomedica, AMELY rappresenta un modello maneggevole per studiare il controllo trascrizionale dei geni della matrice, lo stato di differenziazione e le reti geniche associate alla biomineralizzazione.

Amelogenin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AMELY senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Amelogenin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AMELY nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AMELY, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Amelogenin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AMELY nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Amelogenin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Amelogenin nelle cellule tumorali con espressione di AMELY silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.