AIP4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401677-ACT

Humanes ITCH kodiert die HECT-Typ-E3-Ubiquitin-Ligase AIP4, einen zentralen Regulator des Proteinumsatzes, der die Signaldauer steuert, indem er die Ubiquitinierung sowie die proteasomale oder lysosomale Zielsteuerung spezifischer Substrate katalysiert. AIP4 moduliert mehrere Signalwege, darunter die T‑Zell‑Rezeptor‑Signalübertragung, NF‑κB- und MAPK‑Signalwege sowie die Dynamik des TGF‑β/SMAD‑Signalwegs, und beeinflusst dadurch die Immunhomöostase, Entzündungsprozesse und zelluläre Stressantworten. Durch die Regulation von Stabilität und Trafficking von Rezeptoren und Signaladaptern wirkt sich ITCH auf Apoptose, Differenzierung und Programme im Zusammenhang mit der epithelial–mesenchymalen Transition aus. Eine fehlregulierte ITCH‑Aktivität oder -Expression wurde mit Phänotypen der Immunfehlregulation und veränderten onkogenen Signalnetzwerken in Verbindung gebracht, was ITCH zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien der ubiquitinabhängigen Kontrolle von Signalwegen macht.

AIP4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ITCH-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AIP4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ITCH-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ITCH-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AIP4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ITCH-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AIP4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AIP4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ITCH-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.