AFMID CRISPR Activation Plasmid (h): sc-414235-ACT

Humanes AFMID (Arylformamidase) katalysiert im Tryptophan-Katabolismus die Hydrolyse von N-Formylkynurenin zu Kynurenin und unterstützt damit den Stofffluss entlang der Kynurenin–NAD+-Biosyntheseachse. Indem AFMID die intrazellulären Spiegel von Kynurenin und nachgeschalteten Metaboliten prägt, beeinflusst es die Redoxhomöostase sowie metabolische Signalprogramme, die mit der Mitochondrienfunktion und zellulären Stressantworten gekoppelt sind. Eine dysregulierte Tryptophanverwertung und eine veränderte Aktivität des Kynureninwegs wurden mit Immunmodulation und metabolischem Remodelling in verschiedenen Krankheitskontexten in Verbindung gebracht, wodurch AFMID ein geeigneter Ansatzpunkt für mechanistische Studien zur Kontrolle dieses Signalwegs ist. Expression und Aktivität von AFMID sind daher relevant, um zu untersuchen, wie Nährstoffnutzung mit entzündungsassoziierter Signalübertragung und zellulärer Anpassung zusammenwirkt.

AFMID Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AFMID-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AFMID Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AFMID-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AFMID-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AFMID-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AFMID-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AFMID-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AFMID-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AFMID-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.