Plásmido CRISPR de Activación (m) ACSL4: sc-424503-ACT

El gen Acsl4 de ratón codifica la acil‑CoA sintetasa de cadena larga, miembro 4 (ACSL4), una enzima asociada a membrana que activa ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga al convertirlos en tioésteres de acil‑CoA para su incorporación en fosfolípidos y en rutas metabólicas lipídicas posteriores. ACSL4 es un determinante clave de la remodelación de fosfolípidos y de la composición de membrana sensible al estado redox, vinculando el uso de lípidos con las respuestas al estrés oxidativo y la susceptibilidad a la ferroptosis. Mediante la regulación del metabolismo del ácido araquidónico y del ácido adrenico, ACSL4 influye en la señalización lipídica inflamatoria, la función mitocondrial y la dinámica de membrana. La actividad y la expresión alteradas de ACSL4 se han asociado con patología impulsada por la peroxidación lipídica, y se ha estudiado en contextos que incluyen la neurodegeneración, la disfunción metabólica y la adaptación de las células cancerosas al estrés.

ACSL4 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Acsl4 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ACSL4 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Acsl4 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Acsl4, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ACSL4. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Acsl4 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ACSL4 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ACSL4 en células tumorales con expresión de Acsl4 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.