ACO2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404434-ACT

Das humane ACO2 kodiert die mitochondriale Aconitase 2, ein Eisen-Schwefel-Enzym, das im Tricarbonsäurezyklus (TCA-Zyklus) die Isomerisierung von Citrat zu Isocitrat katalysiert und damit den oxidativen Stoffwechsel sowie die NADH-Produktion zur ATP-Erzeugung durch die Atmungskette unterstützt. Durch die Kopplung des Kohlenstoffflusses an das mitochondriale Redoxgleichgewicht beeinflusst ACO2 den Umgang mit reaktiven Sauerstoffspezies, anaplerotische Reaktionen und die metabolische Anpassung an die Nährstoffverfügbarkeit. Störungen der ACO2-Aktivität wurden mit Phänotypen mitochondrialer Dysfunktion und bioenergetischen Stressantworten in Verbindung gebracht, die sich mit Neurodegeneration, Myopathie und krebsassoziierter metabolischer Umprogrammierung überschneiden. Als zentraler Knotenpunkt des mitochondrialen Stoffwechsels wird ACO2 häufig im Kontext von Hypoxie-Signalgebung, der Kapazität der oxidativen Phosphorylierung und einer metabolitgetriebenen Regulation epigenetischer und stressbezogener Signalwege untersucht.

ACO2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ACO2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ACO2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ACO2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ACO2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ACO2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ACO2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ACO2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ACO2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ACO2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.