Plasmide CRISPR d'Activation (h) ACAT-2: sc-403419-ACT

ACAT2 humain code l’acyl‑CoA:cholestérol acyltransférase 2 (ACAT‑2), une enzyme membranaire du réticulum endoplasmique qui estérifie le cholestérol libre avec des acyl‑CoA d’acides gras à longue chaîne pour produire des esters de cholestérol. Cette réaction contribue au tamponnement intracellulaire du cholestérol, à la formation de gouttelettes lipidiques et à l’assemblage des lipoprotéines, reliant l’activité d’ACAT‑2 à l’homéostasie des stérols et à des programmes plus larges du métabolisme lipidique. La fonction d’ACAT‑2 recoupe des voies qui régulent le trafic du cholestérol, la synthèse lipidique contrôlée par SREBP et les réponses cellulaires au stress lipotoxique ou oxydatif. Une dérégulation du métabolisme des esters de cholestérol a été associée à des phénotypes métaboliques et à la biologie du risque cardiovasculaire, faisant d’ACAT2 une cible utile pour des études mécanistiques dans des modèles pertinents pour les hépatocytes et l’intestin.

ACAT-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ACAT2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ACAT-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ACAT2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ACAT2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ACAT-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ACAT2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ACAT-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ACAT-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de ACAT2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.