15-LO CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401591-ACT

Das humane Gen **ALOX15** kodiert die **15-Lipoxygenase (15-LO)**, eine nicht-hämhaltige Eisen-Dioxygenase, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren wie Arachidon- und Linolsäure oxygeniert und dabei **15-HETE** sowie verwandte Hydroperoxid-Zwischenprodukte erzeugt. Diese Lipidmediatoren prägen Netzwerke aus Eicosanoiden und spezialisierten pro-resolvierenden Mediatoren und beeinflussen die oxidative Lipidumgestaltung, Membrandynamik und Transkriptionsprogramme, die mit der Auflösung von Entzündungen verknüpft sind. Die Aktivität von ALOX15 wird kontextabhängig mit der Differenzierung von Immunzellen, epithelialen Barriereantworten und der mit Ferroptose verbundenen Lipidperoxidation in Zusammenhang gebracht. Eine fehlregulierte 15-LO-Signalgebung wird häufig bei entzündlichen Erkrankungen, Atherosklerose, Asthma und in der Krebsbiologie untersucht, da sie als Treiber eines veränderten Gleichgewichts von Lipidmediatoren und der Signalgebung im Mikromilieu gilt.

15-LO Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ALOX15-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

15-LO Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ALOX15-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ALOX15-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen 15-LO-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ALOX15-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von 15-LO-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des 15-LO-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ALOX15-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.