14-3-3 γ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401063-ACT

YWHAG codifica la proteina adattatrice umana 14-3-3 gamma, un hub di legame alla fosfoserina/fosfotreonina che modula la stabilità, la localizzazione e l’attività di numerosi partner di segnalazione. Attraverso interazioni regolate con chinasi, fosfatasi e regolatori trascrizionali, 14-3-3 gamma contribuisce al controllo del ciclo cellulare, alla segnalazione apoptotica, alla regolazione del metabolismo e alla dinamica del citoscheletro, integrando input da vie quali PI3K/AKT, MAPK e le cascate di risposta allo stress. Un’espressione alterata di YWHAG o uno squilibrio della rete 14-3-3 è stato associato a proliferazione deregolata, segnalazione di sopravvivenza aberrante e disfunzioni neuronali, rendendolo rilevante per studi di biologia del cancro e neurobiologia. Il suo ampio interactoma supporta l’analisi meccanicistica della segnalazione dipendente dalla fosforilazione e della proteostasi in molteplici contesti cellulari.

14-3-3 γ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di YWHAG senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

14-3-3 γ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus YWHAG nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione YWHAG, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di 14-3-3 γ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus YWHAG nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da 14-3-3 γ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via 14-3-3 γ nelle cellule tumorali con espressione di YWHAG silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.