Plasmide CRISPR d'Activation (h) 14-3-3 η: sc-402892-ACT

YWHAH code la protéine adaptatrice humaine 14-3-3 êta (η), un membre de la famille 14-3-3 qui se lie à des motifs phosphosérine/phosphothréonine afin de moduler la localisation et la stabilité des protéines, ainsi que l’assemblage de complexes de signalisation. Grâce à ses interactions avec diverses kinases, phosphatases et régulateurs transcriptionnels, 14-3-3η participe au contrôle, dépendant de la phosphorylation, de la progression du cycle cellulaire, des réponses au stress et de l’apoptose, en s’insérant dans des voies telles que MAPK/ERK, PI3K–AKT et la signalisation RAF. Des altérations de l’activité de YWHAH ont été étudiées dans des contextes de prolifération et de survie dérégulées, notamment des phénotypes liés à la neurobiologie et le remodelage de la signalisation associé au cancer. En tant qu’échafaudage intégrant de multiples signaux, 14-3-3η est fréquemment étudiée pour son impact sur la protéostasie, la dynamique du cytosquelette et des programmes transcriptionnels dépendants du contexte.

14-3-3 η Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de YWHAH sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

14-3-3 η Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus YWHAH dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription YWHAH, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de 14-3-3 η. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus YWHAH natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de 14-3-3 η au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie 14-3-3 η dans les cellules tumorales présentant une expression de YWHAH silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.