Plasmide CRISPR d'Activation (h) γENaC: sc-402577-ACT

SCNN1G code la sous-unité γ du canal sodique épithélial (γENaC), un canal hétérotrimérique sensible à l’amiloride qui assure une entrée électrogène de Na⁺ à travers les membranes apicales du rein, du poumon, du côlon et d’autres épithéliums. La fonction de γENaC s’intègre aux voies de signalisation de l’aldostérone et de la vasopressine pour réguler le transport transépithélial des sels et de l’eau, influençant le volume du liquide extracellulaire, l’homéostasie du liquide de surface des voies aériennes et l’équilibre électrolytique systémique. L’activité du canal est contrôlée par un processing protéolytique, un trafic dépendant de l’ubiquitine via NEDD4-2, ainsi que par des voies cellulaires qui gouvernent sa résidence membranaire et sa probabilité d’ouverture. La dérégulation des sous-unités d’ENaC, y compris SCNN1G, est impliquée dans des troubles de la gestion du sel et de l’hydratation des voies aériennes, ce qui soutient des études mécanistiques en physiologie épithéliale et en biologie du transport ionique.

γENaC Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SCNN1G sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

γENaC Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SCNN1G dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SCNN1G, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de γENaC. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SCNN1G natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de γENaC au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie γENaC dans les cellules tumorales présentant une expression de SCNN1G silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.