Plasmide CRISPR d'Activation (h) XPA: sc-401483-ACT

Le gène humain **XPA** code un facteur central de reconnaissance des dommages à l’ADN dans la voie de réparation par excision de nucléotides (NER). Il vérifie les lésions qui déforment l’hélice et coordonne le recrutement de **TFIIH**, **RPA** et **ERCC1–XPF** afin de permettre la double incision et la synthèse de réparation. En servant d’échafaudage aux complexes de réparation au niveau des photoproduits induits par les UV et des adduits chimiques volumineux, XPA contribue à préserver l’intégrité du génome pendant la réplication et la transcription. Une perturbation ou une baisse d’activité de XPA compromet la capacité de NER, augmentant la charge mutationnelle et la sensibilité cellulaire au stress génotoxique. Le dysfonctionnement de XPA est associé au xeroderma pigmentosum, groupe A, et est fréquemment exploité dans les études portant sur la déficience en réparation de l’ADN, la mutagenèse et la signalisation des réponses au stress.

XPA Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de XPA sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

XPA Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus XPA dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription XPA, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de XPA. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus XPA natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de XPA au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie XPA dans les cellules tumorales présentant une expression de XPA silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.