WTAP CRISPR Activation Plasmid (m): sc-425635-ACT

Wtap kodiert WTAP, eine Kernkomponente des N6‑Methyladenosin-(m6A)-RNA‑Methyltransferasekomplexes, der mit METTL3/METTL14 zusammenwirkt, um die prä‑mRNA‑Prozessierung, alternatives Spleißen, mRNA‑Stabilität und Translation zu regulieren. WTAP unterstützt die Organisation nukleärer Speckles und koordiniert posttranskriptionelle Genregulationsprogramme, die den Zellzyklus, die Festlegung von Zelllinien und Stressantworten beeinflussen. In Mausmodellen beeinträchtigt eine Störung der WTAP-gekoppelten m6A‑Maschinerie die Embryonalentwicklung und die Gewebehomöostase, was seine breite Rolle in der Kontrolle der Genexpression widerspiegelt. Eine fehlregulierte Aktivität des m6A‑Signalwegs unter Beteiligung von WTAP wurde mit veränderter proliferativer Signalgebung und Differenzierungszuständen in Verbindung gebracht, die für die Krebsbiologie und andere Erkrankungen relevant sind, die durch einen gestörten RNA‑Stoffwechsel verursacht werden.

WTAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Wtap-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

WTAP Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Wtap-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Wtap-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen WTAP-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Wtap-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von WTAP-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des WTAP-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Wtap-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.