VPS4B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403260-ACT

VPS4B kodiert eine AAA+-ATPase, die die Disassemblierung und das Recycling von ESCRT-III antreibt – ein Schlüsselschritt bei der endosomalen Sortierung, der Biogenese multivesikulärer Körper (MVB) und dem lysosomalen Abbau von Membranproteinen. Durch die Koordination von Membran-Remodeling-Prozessen trägt VPS4B zur Herunterregulierung von Rezeptoren, zur Zytokinese, zur Reparatur der Plasmamembran und zur Abschnürung bestimmter behüllter Viren bei. Störungen der ESCRT–VPS4-Dynamik können den Cargo-Transport und die resultierenden Signaloutputs verändern und verknüpfen VPS4B-assoziierte Signalwege mit zellulärer Homöostase sowie Stressantworten, die für die Biologie verschiedenster Erkrankungen relevant sind. Als zentraler Regulator des vesikelvermittelten Transports wird VPS4B häufig im Kontext von Proteostase, Membranintegrität und trafficking-abhängigen Signalnetzwerken untersucht.

VPS4B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen VPS4B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

VPS4B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des VPS4B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der VPS4B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen VPS4B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native VPS4B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von VPS4B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des VPS4B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem VPS4B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.