VPS4A CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402005-ACT

Humanes VPS4A kodiert eine AAA+-ATPase, die den Abbau und das Recycling von ESCRT-III antreibt und damit Membranumbauprozesse ermöglicht, die für die Biogenese multivesikulärer Körper, die endosomale Frachtsortierung, die Abszission während der Zytokinese und die Reparatur der Plasmamembran erforderlich sind. Die Aktivität von VPS4A wirkt mit ESCRT-Komponenten zusammen, um die Herunterregulierung von Rezeptoren, die Biogenese von Exosomen und Mikrovesikeln sowie die Abdichtung der Kernhülle nach der Mitose zu steuern. Aufgrund seiner zentralen Rolle im endolysosomalen Transport und bei der Membranfission wird VPS4A häufig in Signalwegen untersucht, die die Proteostase, die angeborene Immunantwort und das virale Budding betreffen, bei dem ESCRT-Maschinerie gekapert wird. Eine Fehlregulation von ESCRT/VPS4-Funktionen wurde mit neurodegenerativen Phänotypen, veränderter Wachstumsfaktor-Signalgebung sowie krebsassoziierten Veränderungen im Vesikeltransport und in der Zellteilung in Verbindung gebracht.

VPS4A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen VPS4A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

VPS4A Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des VPS4A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der VPS4A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen VPS4A-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native VPS4A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von VPS4A-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des VPS4A-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem VPS4A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.