Plasmide CRISPR d'Activation (h) VPS25: sc-404109-ACT

Le VPS25 humain code une sous-unité centrale du complexe ESCRT-II, qui coordonne le tri endosomal et la biogenèse des corps multivésiculaires, permettant l’acheminement de protéines membranaires ubiquitinylées vers la dégradation lysosomale. Par le remodelage membranaire dépendant d’ESCRT, VPS25 contribue à la diminution des récepteurs, au maintien de l’homéostasie des protéines membranaires et, plus largement, au contrôle de l’intensité et de la durée des signaux. La machinerie ESCRT intervient également dans la cytokinèse et la dynamique membranaire liée à l’autophagie, reliant la fonction de VPS25 à la division cellulaire et à une protéostasie adaptative en situation de stress. Une dérégulation du trafic endosomal-lysosomal et des composants de la voie ESCRT est associée à une altération de la signalisation des facteurs de croissance, à un renouvellement protéique déficient, ainsi qu’à des phénotypes cellulaires pertinents pour les maladies neurodégénératives et le cancer.

VPS25 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de VPS25 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

VPS25 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus VPS25 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription VPS25, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de VPS25. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus VPS25 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de VPS25 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie VPS25 dans les cellules tumorales présentant une expression de VPS25 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.