von Willebrand Factor/VWF CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400217-ACT

VWF kodiert den von-Willebrand-Faktor, ein großes multimeres Glykoprotein, das von Endothelzellen und Megakaryozyten produziert wird und für die primäre Hämostase essenziell ist. VWF vermittelt unter hoher Scherbelastung die Adhäsion von Thrombozyten an freigelegtes subendotheliales Kollagen und stabilisiert den Gerinnungsfaktor VIII, wodurch die Thrombozytenanheftung mit der intrinsischen Gerinnungskaskade verknüpft wird. Das Protein wird in Weibel-Palade-Körperchen und in α-Granula der Thrombozyten gespeichert und durch Multimerprozessierung und proteolytische Spaltung reguliert, was Thrombose und vaskuläre Integrität beeinflusst. Eine Fehlregulation oder genetische Variation von VWF ist mit Blutungs- und thrombotischen Phänotypen assoziiert und wird in der Endothelbiologie, der Thrombozytenfunktion und der Forschung zu Gerinnungswegen umfassend untersucht.

von Willebrand Factor/VWF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen VWF-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

von Willebrand Factor/VWF Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des VWF-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der VWF-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen von Willebrand Factor/VWF-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native VWF-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von von Willebrand Factor/VWF-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des von Willebrand Factor/VWF-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem VWF-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.