Vimentin CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400035-ACT

VIM kodiert Vimentin, ein Intermediärfilamentprotein des Typs III, das einen wesentlichen Bestandteil des Zytoskelettnetzwerks in mesenchymalen Zellen bildet. Vimentin reguliert die Zellform, die mechanische Belastbarkeit, die Positionierung von Organellen sowie die Adhäsionsdynamik und steht mit den Aktin- und Mikrotubuli-Systemen in Wechselwirkung, um Migrations- und Wundantwortprogramme zu koordinieren. Seine Expression wird häufig als Marker der epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) verwendet und ist mit Veränderungen der Zytoskelett-Remodellierung, des Turnovers fokaler Adhäsionen sowie von Signalwegen verknüpft, die Motilität und Invasion steuern. Eine dysregulierte Vimentin-Expression wurde mit Fibrose, entzündlichen Zuständen und Phänotypen der Krebsprogression in Zusammenhang gebracht, was Vimentin zu einem relevanten Ziel für die Untersuchung zellulärer Plastizität und Stressanpassung macht.

Vimentin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen VIM-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Vimentin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des VIM-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der VIM-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Vimentin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native VIM-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Vimentin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Vimentin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem VIM-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.