Plasmide CRISPR d'Activation (h) Vav2: sc-401490-ACT

Le gène humain VAV2 code Vav2, un facteur d’échange de nucléotides guanyliques (GEF) de la famille Rho qui catalyse l’échange GDP–GTP sur Rac1, RhoA et Cdc42 afin de coordonner le remodelage du cytosquelette d’actine, l’adhésion cellulaire et la migration directionnelle. Vav2 agit en aval des récepteurs tyrosine kinases, des intégrines et des récepteurs immunitaires, reliant des signaux extracellulaires à des programmes cytosquelettiques et transcriptionnels via des voies qui recoupent les signalisations MAPK et PI3K. Par ces fonctions, Vav2 contribue à réguler la morphologie cellulaire, l’endocytose et les modifications de la motilité ainsi que des phénotypes liés à l’invasion dépendant des signaux. Une expression ou une signalisation dérégulée de VAV2 a été associée à des programmes aberrants de prolifération et de migration en cancérologie, ainsi qu’à des contextes de signalisation immunitaire et vasculaire altérés, pertinents pour les mécanismes de maladie.

Vav2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de VAV2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Vav2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus VAV2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription VAV2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Vav2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus VAV2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Vav2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Vav2 dans les cellules tumorales présentant une expression de VAV2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.